近日，國(guó)家衛(wèi)健委舉辦全國(guó)視頻會(huì)議，明確提出“所有縣區(qū)級(jí)以上疾控機(jī)構(gòu)、二級(jí)以上綜合醫(yī)院要抓緊進(jìn)行改造，在短時(shí)間內(nèi)形成核酸檢測(cè)能力”。你們醫(yī)院開始了嗎？

各地的公立機(jī)構(gòu)檢測(cè)能力不能滿足需求只是暫時(shí)的，獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室在充實(shí)檢測(cè)力量的同時(shí)，發(fā)揮自己豐富的檢驗(yàn)管理運(yùn)營(yíng)理念，以及區(qū)域化覆蓋的經(jīng)驗(yàn)優(yōu)勢(shì)，融入到“國(guó)家隊(duì)”核酸檢測(cè)能力的建設(shè)中，順勢(shì)而為，乘勢(shì)而上。

二級(jí)醫(yī)院將面臨多種挑戰(zhàn)

開展病毒核酸聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)，對(duì)檢測(cè)場(chǎng)地、實(shí)驗(yàn)人員以及防護(hù)措施都有很高的要求。三級(jí)醫(yī)院都有PCR實(shí)驗(yàn)室，達(dá)到新冠病毒核酸檢測(cè)條件并不難，而對(duì)于多數(shù)二級(jí)醫(yī)院來說，卻存在著諸多難點(diǎn)。

難點(diǎn)1

場(chǎng)地要求高

場(chǎng)地?zé)o疑是最大的難點(diǎn)之一。新冠病毒核酸檢測(cè)需要標(biāo)準(zhǔn)的四區(qū)分隔和氣流控制：試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備、PCR擴(kuò)增檢測(cè)和擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)四個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)，同時(shí)各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染（人物分流）。

難點(diǎn)2

人員要求高

進(jìn)入PCR實(shí)驗(yàn)室的檢驗(yàn)工作者，需要經(jīng)過從基礎(chǔ)理論、實(shí)驗(yàn)原理、規(guī)范操作、質(zhì)量保證到注意事項(xiàng)等規(guī)范的培訓(xùn)，并獲取PCR上崗證。二級(jí)醫(yī)院人才相對(duì)短缺，操作經(jīng)驗(yàn)欠缺，檢測(cè)準(zhǔn)確性待確認(rèn)，也需要投入更多人力資源。

難點(diǎn)3

檢測(cè)風(fēng)險(xiǎn)與防護(hù)高

檢測(cè)過程中，樣本的開蓋，核酸提取的震蕩、離心都有可能產(chǎn)生氣溶膠，有感染的風(fēng)險(xiǎn)，個(gè)人防護(hù)必須按照生物安全三級(jí)實(shí)驗(yàn)室的個(gè)人防護(hù)要求進(jìn)行。

難點(diǎn)4

經(jīng)費(fèi)不足

二級(jí)醫(yī)院，經(jīng)費(fèi)不多，對(duì)于建設(shè)PCR實(shí)驗(yàn)室、購買大型的實(shí)驗(yàn)設(shè)備較為吃力。

由此看來，二級(jí)醫(yī)院要逐步達(dá)到新冠病毒核酸檢測(cè)條件，確實(shí)存在著諸多難點(diǎn)……

隨著各地都在建立PCR實(shí)驗(yàn)室，本文從硬件基礎(chǔ)的角度，梳理了PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)的幾個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)，獨(dú)立醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室可以運(yùn)用豐富的運(yùn)營(yíng)經(jīng)驗(yàn)，進(jìn)行建設(shè)指導(dǎo)、人員梯隊(duì)建立、質(zhì)控體系搭建、區(qū)域化服務(wù)支持等。

如何建設(shè)PCR實(shí)驗(yàn)室

與PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)相關(guān)的指導(dǎo)文件主要有四份：

• 《醫(yī)療機(jī)構(gòu)管理?xiàng)l例》符號(hào)列表

• 《醫(yī)療機(jī)構(gòu)臨床實(shí)驗(yàn)室管理辦法》

• 《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》

• 《臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理暫行辦法》
  

要求臨床PCR實(shí)驗(yàn)室，不但在實(shí)驗(yàn)室設(shè)置及儀器設(shè)備等硬件上要滿足開展臨床檢驗(yàn)的條件，而且要求實(shí)驗(yàn)室在日常工作要有文件化的工作程序。

下面就在PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)過程中的幾個(gè)關(guān)鍵控制點(diǎn)進(jìn)行闡述:

01

建立PCR實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量管理體系

根據(jù)實(shí)驗(yàn)室的具體情況編寫質(zhì)量體系文件，《質(zhì)量手冊(cè)》、《程序文件》、《作業(yè)指導(dǎo)書》，并保證管理體系運(yùn)行有效。

管理體系的特點(diǎn)是應(yīng)有明確的目的、規(guī)范的管理、有效的制約、高效的機(jī)制、能自我發(fā)展的整體。

建立完善的SOP文件，對(duì)完成各項(xiàng)質(zhì)量活動(dòng)的方法作出規(guī)定，每個(gè)SOP都應(yīng)對(duì)一個(gè)或一組相互關(guān)系的活動(dòng)進(jìn)行描述。

每個(gè)SOP文件應(yīng)說明該項(xiàng)質(zhì)量各環(huán)節(jié)的輸入、轉(zhuǎn)換和輸出所需的文件、物資、人員、記錄以及它們與有關(guān)活動(dòng)的接口關(guān)系。

明確每個(gè)環(huán)節(jié)轉(zhuǎn)換過程中各項(xiàng)因素的要求，即由誰做、做什么、做到什么程序、達(dá)到什么要求，如何控制、形成什么記錄和報(bào)告，以及相應(yīng)的審批手續(xù)。

規(guī)定在質(zhì)量活動(dòng)中需要注意的例外或特殊情況的糾正措施。SOP應(yīng)簡(jiǎn)練、明確和易懂并且工作人員熟練掌握和嚴(yán)格遵守。

02

PCR實(shí)驗(yàn)室的相關(guān)設(shè)置

要完成一組PCR實(shí)驗(yàn)，通常需要經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增和產(chǎn)物分析4個(gè)實(shí)驗(yàn)過程。

這4個(gè)實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房應(yīng)相鄰布置，組成一個(gè)獨(dú)立的PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)的PCR實(shí)驗(yàn)區(qū)包括:試劑準(zhǔn)備區(qū)、標(biāo)本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)、各區(qū)配套的緩沖區(qū)及公共走廊。

PCR實(shí)驗(yàn)室整體平面布局

某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局如圖所示，整個(gè)區(qū)域有一個(gè)公用走廊，每個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)有專門的緩沖區(qū)。通過壓差控制，使整個(gè)PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染，并且降低擴(kuò)增產(chǎn)物對(duì)人員和環(huán)境的污染。

▲某醫(yī)院PCR實(shí)驗(yàn)室平面圖

試劑準(zhǔn)備區(qū)

該實(shí)驗(yàn)區(qū)主要進(jìn)行的操作為貯存試劑的制備、試劑的分裝和主反應(yīng)混合液的制備。

試劑和用于標(biāo)本制作的材料應(yīng)直接運(yùn)送至該區(qū)，不得經(jīng)過其他區(qū)域。試劑原材料必須貯存在本區(qū)內(nèi)，并在本區(qū)內(nèi)制備成所需的貯存試劑。

試劑準(zhǔn)備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-80°C冰箱，計(jì)算冷負(fù)荷時(shí)，需要將它們計(jì)算在內(nèi)。

房間的面積宜控制在15m2~20m2。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)正壓狀態(tài)，以防止外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染。

標(biāo)本制備區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為臨床標(biāo)本的保存、核酸(RNA、DNA)提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管和測(cè)定RNA時(shí)cDNA的合成。

標(biāo)本制備區(qū)配備有2~8°C冰箱和-20°C冰箱，計(jì)算冷負(fù)荷時(shí)，需要將它們計(jì)算在內(nèi)。在標(biāo)本制備區(qū)，還需要配備生物安全柜，用于進(jìn)行提取核酸的操作。

為避免提取的核酸在柜內(nèi)反復(fù)循環(huán)，造成標(biāo)本之間的交叉污染，出現(xiàn)假陽性結(jié)果，該區(qū)域配備的生物安全柜必須是B2型的。生物安全柜工作區(qū)垂直氣流全部來自實(shí)驗(yàn)室，排風(fēng)經(jīng)過高效過濾器過濾后直接排至室外，不允許回到安全柜和實(shí)驗(yàn)室中。

根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果實(shí)驗(yàn)室內(nèi)配備生物安全柜，每配備一臺(tái)，實(shí)驗(yàn)室的面積增加10m2;標(biāo)本制備區(qū)的面積宜在25m2~30m2之間。本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)檎龎?，以避免從鄰近區(qū)進(jìn)入本區(qū)的氣溶膠污染。

擴(kuò)增室

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為DNA或cDNA擴(kuò)增。此外，已制備的DNA模板和合成的cDNA(來自樣本制備區(qū))的加入和主反應(yīng)混合液(來自試劑貯存和制備區(qū))制備成反應(yīng)混合液等也可在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

在巢式PCR測(cè)定中，通常在第一輪擴(kuò)增后必須打開反應(yīng)管，因此巢式擴(kuò)增有較高的污染危險(xiǎn)性，第二次加樣必須在本區(qū)內(nèi)進(jìn)行。

擴(kuò)增室主要配備PCR實(shí)驗(yàn)室的核心儀器PCR儀，本文實(shí)例中使用了ABI7500和ABI9700兩種PCR儀。

在實(shí)驗(yàn)室建造過程中，需要給PCR儀配備專門的UPS電源，以保證其正常工作。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。

本區(qū)的壓力梯度要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免氣溶膠從本區(qū)漏出。為避免氣溶膠所致的污染，應(yīng)盡量減少在本區(qū)內(nèi)的不必要的走動(dòng)。個(gè)別操作如加樣等應(yīng)在超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。

產(chǎn)物分析區(qū)

該區(qū)域主要進(jìn)行的操作為擴(kuò)增片段的測(cè)定。如使用全自動(dòng)封閉分析儀器檢測(cè)，此區(qū)域可不設(shè)。

在室內(nèi)配備通風(fēng)櫥，保證房間內(nèi)的相對(duì)負(fù)壓，空氣從室外流向室內(nèi)。該區(qū)面積控制在15m2~20m2。

本區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，因此對(duì)本區(qū)的壓力梯度的要求為:相對(duì)于鄰近區(qū)域?yàn)樨?fù)壓，以避免擴(kuò)增產(chǎn)物從本區(qū)擴(kuò)散至其它區(qū)域。建議采用5~10Pa壓差，在控制上比較容易實(shí)現(xiàn)。

03

正負(fù)壓區(qū)域緩沖室的設(shè)置

根據(jù)壓力梯度的要求，試劑配制室和樣品處理室為相對(duì)正壓，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室為相對(duì)負(fù)壓，要求正壓的區(qū)域和要求負(fù)壓的區(qū)域的緩沖室內(nèi)的壓力設(shè)計(jì)大不相同。

正壓緩沖室符合一般正壓潔凈室的緩沖原則，主要是防止室外環(huán)境空氣中的氣溶膠進(jìn)入室內(nèi)。正壓緩沖室的布置如圖所示。

▲正壓緩沖室的布置圖

負(fù)壓緩沖室則是要求緩沖室對(duì)核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析區(qū)保持正壓，對(duì)緩沖室外也保持正壓(主要是滿足室內(nèi)凈化需要，如室內(nèi)無潔凈要求，此處可以為0壓)。負(fù)壓緩沖室的布置如圖3所示。

▲負(fù)壓緩沖室的布置圖

04

污染的預(yù)防與控制

PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型:擴(kuò)增產(chǎn)物的污染;天然基因組DNA的污染;試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。

工作區(qū)域的嚴(yán)格劃分，各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域要有明顯的標(biāo)記(如醒目的門牌或不同的地面顏色等)，以避免各個(gè)不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域設(shè)備物品、試劑等發(fā)生混淆。

合理的系統(tǒng)設(shè)置，合理的空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)置，盡量采用全送全排的空調(diào)系統(tǒng);嚴(yán)格的氣流壓力控制，保證不同的實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不同的壓力要求。

規(guī)范的操作，臨床基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室的技術(shù)人員必須進(jìn)行上崗培訓(xùn)，在實(shí)驗(yàn)操作過程中，操作者必須戴手套，并經(jīng)常更換。清潔工作及時(shí)、正確。實(shí)驗(yàn)工作結(jié)束后，必須立即對(duì)本區(qū)進(jìn)行清潔。

嚴(yán)格的管理:嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。在各個(gè)實(shí)驗(yàn)區(qū)域使用帶有明顯區(qū)別標(biāo)志的工作服(如不同顏色)，當(dāng)工作人員離開時(shí)不得將本區(qū)的工作服帶至其它區(qū)域;盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動(dòng)以減少交叉污染的可能性。擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等;

總之，實(shí)驗(yàn)室建設(shè)是一個(gè)復(fù)雜的問題，這里不討論人員的問題，實(shí)驗(yàn)室人員的培養(yǎng)與沉淀，也需要一個(gè)過程，在建設(shè)的過程中要因地制宜，不要生搬硬套，結(jié)合自己的實(shí)際慢慢摸索出適合自己發(fā)展的建設(shè)思路?？茖W(xué)合理建設(shè)實(shí)驗(yàn)室，更好的發(fā)揮實(shí)驗(yàn)室的作用。

來源：檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)

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